南阳市卧龙区盛隆锅炉厂
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(1)预备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管,食用菌灭菌锅炉要求能耐受温度突然改变而不致决裂,因而,需求选用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管,安瓿管的巨细一般运用75×10mm的,或能容1.2mm液体的。
(2)加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等简略分散的细胞时,则将空安瓿管塞上棉塞,1.05kg/cm2,121.3℃灭菌15分钟:若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先参加保护剂如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液,参加量以能浸没今后参加的菌落圆块为限,然后再用1.05kg/cm2>,121.3℃灭菌15分钟。
(3)接入菌种将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液,装入已灭菌的安瓿管;霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器,从平板内切取菌落圆块,放入含有保护剂的安瓿管内,然后用火焰熔封。浸入水中查看有无缝隙。
(4)冻住再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻住至-30℃。若细胞急剧冷冻,则在细胞内会构成冰的结晶,因而下降存活率。
(5)保藏经冻住至-30℃的安瓿管当即放入液氮冷冻保藏器(图Ⅶ-14)的小圆筒内,然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃,液态氮内为-196℃。
(6)恢复培育保藏的菌种需求用时,将安瓿管取出,当即放入38—40℃的水浴中进行急剧冻住,直到悉数消融停止。再打开安瓿管,将内容物移入适合的培育基上培育。
此法除适合于一般微生物的保藏外,对一些用冷冻枯燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以构成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长时刻保藏,并且性状不变异。缺陷是需求特别设备。
冷冻枯燥保藏法
(1)预备安瓿管用于冷冻枯燥菌种保藏的安瓿管宜选用中性玻璃制造,形状可用长颈球形底的,亦称泪滴型安瓿管(图Ⅶ-15),巨细要求外径6—7.5mm,长105mm,球部直径9—11mm,壁厚0.6—1.2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞,1.05kg/cm2>,121.3℃灭菌30分钟,备用。
(2)预备菌种,用冷冻枯燥法保藏的菌种,其保藏期可达数年至十数年,为了在许多年后不出过失,故所用菌种要特别留意其纯度,即不能有杂菌污染,然后在最适培育基中用最适温度培育,使培育出杰出的培育物。细菌和酵母的菌龄要求超越对数成长时刻,若用对数成长时刻的菌种进行保藏,其存活率反而下降。一般,细菌要求24—48小时的培育物;酵母需培育3天;构成孢子的微生物则宜保存孢子;放线菌与丝状真菌则培育7—10天。
(3)制备菌悬液与分装以细菌斜面为例,用脱脂牛乳2ml左右参加斜面试管中,制成浓菌液,每支安瓿管分装0.2ml。
(4)冷冻冷冻枯燥器有成套的设备出售,价值贵重,此处介绍的是简易办法与设备,可到达相同的意图。
将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻,无低温冰箱可用冷冻剂如干冰(固体CO2>)酒精液或干冰丙酮液,温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂,只需冷冻4—5分钟,即可使悬液结冰。
(5)真空枯燥为在真空枯燥时使样品坚持冻住状态,需预备冷冻槽,槽内放碎冰块与食盐,混合均匀,可冷至-15℃。设备仪器如图Ⅶ-16,安瓿管放入冷冻槽中的枯燥瓶内。
抽气一般若在30分钟内能到达93.3Pa(0.7mmHg)真空度时,则枯燥物不致熔化,今后再继续抽气,几小时内,肉眼可调查到被枯燥物已趋枯燥,一般抽到真空度26.7Pa(0.2mmHg),坚持压力6—8小时即可。
(6)封口抽真空枯燥后,取出安瓿管,接在封口用的玻璃管上,可用L形五通管(图Ⅶ-17)继续抽气,约10分钟即可到达26.7Pa(0.2mmHg)。于真空状态下,以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中心进行封口。封口今后,保存于冰箱或室温暗处。
此法为菌种保藏办法中最有用的办法之一,对一般生生机强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用,即便对一些很难保存的致病菌,如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长时刻保存,一般可保存数年至十余年,但设备和操作都比较复杂。